Lisado de amebocito de Limulus.
ALEJANDRO MELO FLORIÁN M.D., FACP
Especialista en Medicina Interna
Bogotá D.C. – Colombia
El lisado de amebocito de limulus es una prueba que detecta endotoxinas bacterianas, siendo de utilidad en clínica cuando hay situaciones donde los hemocultivos arrojan resultados negativos. La prueba se basa en la gelación de las proteínas del sistema de coagulación contenidas en los amebocitos circulantes en la hemolinfa del cangrejo bayoneta – Limulus polyphemus.
La utilidad de este sistema es que permite cuantificar la cantidad de endotoxina presente. Hay tres ensayos básicos de LAL, que son el simple, el turbidométrico y el cromogénico. Se prefieren los ensayos cuantitativos, como el cromogénico.
Contents
- Introducción
- Principios Biológicos.
- LAL y endotoxina
- Inhibición del LAL por suero y plasma.
- Procedimientos Básicos de determinación de LAL
- Aplicaciones Clínicas.
- Sobre el autor
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Knoles en Infectología por Alejandro Melo MD, FACP
Miembro de Asociación Colombiana de Infectología – ACIN
Introducción
En 1902 Loeb reportó la coagulación intravenosa en el cangrejo bayoneta [Lymulus polyphemus]. En 1956 Bang hizo un extenso reporte sobre coagulación vascular diseminada y muerte a consecuencia de una enfermedad en estos cangrejos, la cual en 1964 fué identificada por Bang y Levine como mediada por endotoxina. En 1968 Bang y Levine demostraron que la reacción de gelación que ocurría era debida a una reacción enzimática que requería la presencia de endotoxina y de proteínas del sistema de coagulación contenidas en los amebocitos circulantes.
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Tachypleius tridentatus Fotografía de dominio público, cortesía de Binh Giang. |
Las células sanguíneas circulantes [amebocitos] del sistema circulatorio [hemolinfa] presentes en ciertas especies de Limúlidos, en especial el gangrejo bayoneta [Lymulus polyphemus] y el cangrejo japonés [Tachypleius tridentatus spp.] contienen gránulos de proteína que se gelifica en la presencia de endotoxina de muchas especies de Gram negativos [ Webster, CJ., J Clin Microbiol 1980].
El hemocito granular o amebocito es la principal célula circulante en el cangrejo adulto. Se caracteriza por contener gránulos grandes y pequeños: los gránulos mayores contienen 4 factores de coagulación y un factor antimicrobiano [factor anti LPS], se liberan más rápidamente que los pequeños, ambas poblaciones se liberan por exocitosis y coagulación, con un lapso de aprox. 90 segundos. El mecanismo de reacción se basa en enzimas con actividad de proteasas de serina en forma de zimógenos [factores C, B, una enzima procoagulante, y el coagulógeno].
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Hemocito de Limulus Crédito de imagen: http://www.mbl.edu/marine_org/images/animals/Limulus/blood/bang.html |
Esta reacción ha sido empleada como la base de un ensayo cualitativo o semicuantitativo para endotoxina, siendo el reactante la proteína obtenida de los amebocitos lisados deLymulus, ensayo conocido como Lisado de Amebocito de Limulus [LAL] [Webster, CJ., J Clin Microbiol 1980].
El objetivo final de este ensayo es la detección de la gelación de la proteína después de ser incubada con endotoxina bajo ciertas condiciones.
Principios Biológicos.
El sistema de coagulación de Lymulus polyphemus está contenido en los amebocitos, y las proteínas derivadas de los amebocitos lisados se coagulan en presencia de la endotoxina, siendoa la rata de esta reacción dependiente de la concentración de endotoxina [ Young, NS., et al, J Clin Invest 1972]. Bang y Levine fueron los primeros en sugerir que la gelación inducida por endotoxina era mediada enzimáticamente. El mecanismo de reacción se cree que implica la activación de una enzima procoagulante por Ca ²+ y endotoxina. Esta enzima activada cataliza la ruptura hidrolítica de una proteína coagulable [coagulógeno] a subunidades polipeptídicas.
La naturaleza química del coagulógeno ha sido estudiada en las dos especies de limúlidos descritos: en el cangrejo bayoneta, el coagulógeno es un polipéptido de 235 residuos de aminoácidos. La coagulación ocurre por clivaje en el aminoácido 45 a partir del carboxilo terminal, resultando en la liberación de un péptido C soluble, y un residuo insoluble de 170 aminoácidos. Este péptido insoluble de 170 residuos se denomina coagulina, y es el responsable de la polimerización para formar un coágulo estable.
El mecanismo por el cual el coagulógeno es clivado por la enzima procoagulante se cree que es similar al de la tripsina, una hidrolasa de serina, o al de la activación de protrombina para formar trombina [Young, NS., et al, J Clin Invest 1972].
LAL y endotoxina
En 1892, Richard Pfeiffer y Richard Panum descubrieron la endotoxina, al experimentar con V. cholerae ; hacia esta época Eugenio Cerami realiza en S. tiphy la extracción de la denominada pirotoxina, por inducir fiebre en conejos al ser inoculada. Hoy se conoce que la endotoxina de Pfeiffer y la pirotoxina de Cerami son la endotoxina común a los microorganismos gram negativos.
En la primera mitad del siglo se concluyó que la endotoxina bacteriana está conformada por polisacáridos, lípidos y proteínas. Hacia 1943, Murray Shear describe el término de lipopolisacárido o LPS para denominar la endotoxina, hoy conocidas como la misma substancia.
En la actualidad se acepta que las alteraciones fisiopatológicas y las manifestaciones clínicas del proceso séptico son el resultado de la interacción entre la endotoxina bacteriana y las células del sistema inmune del huésped, en particular los macrófagos, los cuales producen citoquinas y otros mediadores de la inflamación. Los efectos de los patógenos gram negativos son independientes de la viabilidad bacteriana [Rietschel, ET., et al, Infect Dis Clin NA 1991].
La mejoría en la sensibilidad y especificidad del ensayo de LAL permite sustentar la significancia de la endotoxina en estados sépticos, la positividad de LAL en plasma se correlaciona con hipotensión y aumento de la mortalidad; la endotoxemia se ha postulado como un predictor confiable en la sepsis por gram negativos: los niveles de endotoxemia >> a 800 pg/ml en meningococcia se correlacionan con evolución a choque y falla de múltiples sistemas orgánicos [Rietschel, ET., et al, Infect Dis Clin NA 1991].
Es importante el concepto de endotoxina libre, la cual se postuló inicialmente por Crutchley et al. en 1967, describiendo al lipolisacárido liberado en cultivos de E. coli debido a sobreproducción metabólica de material de pared durante crecimiento rápido, aunque la endotoxina libre se origina de solubilización o «descamación» de células en reposo [Jorgensen, JH., et al, Proceed Soc Exp Biol Med 1974].
Este LPS libre, o el asociado a la pared celular es detectable por LAL: el LPS ligado a la superficie celular permanece relativamente constante y podría permitir una cuantificación de los microorganismos viables en la muestra [Jorgensen, JH., et al, Proceed Soc Exp Biol Med 1974].
Importancia de la endotoxina
La endotoxina (E´) es uno de los predictores de la evolución de la sepsis producida por gramnegativos, y hay relación cuantitativa entre los niveles de endotoxina y el desarrollo de complicaciones como el Síndrome de Dificultad Respiratoria del Adulto (SDRA) y choque séptico, cuando sus niveles son superiores a 800 picogramos/mL [Parrillo JE Ann Int Med 1990; Wolff SM, N Eng J Med 1991].
La endotoxina es una macromolécula compleja de la pared celular de las bacterias gram negativas. Está compuesta de una mitad altamente conservada de lípido A, una región central de polisacáridos covalentemente ligada o «core», y una cadena lateral O, distalmente ligada. La región del «core» y la del lípido A son estructuralmente semejantes en una amplia gama de gram – negativos [Jacobs RF, et al. Crit Care Clin 1989; Harkonen S, et al. Antimicrob Agents Chemother 1988]. La región del «core» consiste en una serie de sacáridos repetitivos como el ácido 3-desoxi D-mano octolusónico; el Lípido A está embebido en la membrana externa y consiste en residuos de diglucosamina asociados con ácidos grasos no hidroxilados de 12 – 14 carbonos.
Información adicional sobre endotoxina
http://www.scoop.it/t/temas-varios-sobre-microbiologia-clinica
Inhibición del LAL por suero y plasma.
La presencia de sustancias en sangre que son capaces de inihibir la enzima procoagulante de LAL son reconocidos [Webster, CJ., J Clin Microbiol, 1980], por lo cual son necesarios métodos para su remoción: dentro de estos se citan la extracción con cloroformo, dilución, absorción de endotoxina, y cambio de pH del plasma, y dilución y precipitación con sulfato de amonio, seguido de calentamiento [ Webster, CJ., J Clin Microbiol, 1980]. El consenso sobre la mejor técnica parece converger en la de calentamiento y dilución para la remoción de inhibidores [Cohen, J., et al, J Infect Dis 1984].
La mayor parte de ensayos se prefieren realizar en plasma, por los hallazgos de Levin, en que hay menos endotoxina detectable por LAL en el suero, debido a que la endotoxina se liga rápidamente a la sangre que está en coagulación, o se inactiva durante la coagulación. Sin embargo debe destacarse el hecho que una fracción sustancial de la actividad perdida de endotoxina puede ser restaurada por dilución, indicando que esta inactivación es potencialmente reversible.
La endotoxina en sangre se liga a proteínas plasmáticas, y es inactivada por proteínas con actividad de tripsina. Esto puede afectar la demostración de endotoxina en el ensayo de LAL. El inhibidor de LAL presente en el plasma puede ser inactivado por el proceso de coagulación normal, pero en la presencia de endotoxina no es muy afectado por este proceso: este inhibidor puede ser la antitrombina II, la cual inhibe esterasas de serina, o también la alfa 1 antitripsina y la alfa 2 microglobulina; curiosamente los anticuerpos contra las cadenas laterales O, o contra el lípido A no afectan el LAL [ Webster CJ., J Clin Microbiol 1980].
También se han implicado como inhibidores a enzimas de la cascada de coagulación, las cuales tiene similitud con el complejo LPS-LAL-cromógeno, a proteínas de alta densidad específicas por LPS, aunque de estas últimas se desconocen efectos en los test de endotoxemia [Cohen, J., et al, J Infect Dis 1984].
Procedimientos Básicos de determinación de LAL
Bajo condiciones normales [36 a 38 °C, pH 6 a 7,5] la proteína derivada de amebocitos lisados deLymulus poliphemus se coagula hacia 1 hora después de la exposición a pequeñas cantidades de LPS. El componente activo de esta reacción se atribuye al lípido A, el cual en concentraciones tan bajas como 0,1 ng/ml es capaz de producir la gelación del lisado de amebocitos [ Gray, LD., Fedorko, DP., Clin Microbiol Reviews 1992].
Hay 3 procedimientos básicos aprobados porla Food Drugand Administration Bureau [FDA] para los ensayos de LAL. En el ensayo simple de LAL se busca finalmente la gelación del lisado del amebocito: el test se ejecuta incubando 0,1 ml de lisado con 0,1 ml de fluído de la muestra por analizar, durante 1 h a 37°C, e invirtiendo la mezcla a 180° para determinar si un coágulo se ha formado. La determinación si un coágulo se ha formado parcial o completamente es difícil, y puede dificultar la lectura de los puntos finales.
El LAL turbidométrico implica el uso de espectrofotómetro para medir el cambio en la densidad óptica que ocurre durante la rección de gelación.
En el ensayo de LAL con substrato cromogénico, un sustrato sintético productor de color [el cual contiene p-nitroanilina como cromógeno], se usa un ensayo modificado de LAL; la formación de coágulo como estadio final se elimina, y se reemplaza por la detección de color amarillo. En estos tres ensayos es importante el uso de material libre de pirógenos [Gray, LD., Fedorko, DP., Clin Microbiol Reviews 1992].
La modificación de LAL en el ensayo cromogénico, introducido por Iwanaga [Thomas, LLM., et al, Clin Chim Act 1981], se basa en que la enzima activa de LAL tiene actividad de amidasa y puede clivar el sustrato cromógeno de su portador péptido sintético, de manera que se produce un color amarillo cuya intensidad es proporcional a la concentración de endotoxina. Ofrece la ventaja sobre el método simple de un menor tiempo de incubación [13-30 min vs 1hora], no está predispuesto a disrupción mecánica, y es adaptable a sistema de microplaca. Además mejora la sensibilidad en aprox. 10 veces y permite cuantificación de LPS [Thomas, LLM., Clin Chim Act 1981].
Aplicaciones Clínicas.
La eficacia clínica del LAL en la detección de endotoxina según los diferentes reportes clínicos, no se ha podido establecer, debido a reportes contradictorios. Esto se ha atribuído a la presencia de inhibidores, ya mencionados antes.
Por ejemplo en meningitis, el LAL en estudio de LCR es muy sensible y específico para la detección de endotoxina. Correctamente ejecutado permite la detección de 1000 bacterias/ml, con cifras de sensibilidad de 93 % y de especificidad de 99,4 %, siendo los principales gérmenes detectados H. influenza tipo b, N. meningitidis, E. coli, Pseudomonas spp., Serratia marcescens, K. pneumoniae[Gray, DL., Fedorko, DP., Clin Microbiol Reviews 1992]. Sin embargo, este test en examen de LCR no ha tenido una difusión muy amplia porque se detectan solamente gérmenes gram negativos y no se identifica el agente causal.
Comparación de lisado de limulus frente a hemocultivos.
Al comparar con hemocultivos, Elin en 1979 concluyó que la relevancia clínica no se podía establecer [Thomas, L et al, Am J Clin Pathol 1984] reportándose inconsistencia en la detección de LPS por variaciones en la sensibilidad de los lotes de LAL, variabilidad en la formación de gel, y la presencia de inhibidores.
Al realizar estudios cuantitativos sobre bacteriemia, se describió que era necesaria la presencia de más de 1.000 microorganismos/ml para que hubiera positividad en el LAL. Sin embargo, se afirma que el ensayo cromogénico mejora la sensibilidad y teóricamente puede detectar una endotoxemia clinicamente relevante en la ausencia de bacterias gram negativas intactas circulantes [Thomas, LLM., et al, Am J Clin Pathol 1984; Shands, JW., et al, J Infect Dis 1989]. Al comparar la detección de endotoxemia contra hemocultivo como regla de oro, se encuentran sensibilidad del 67 % especificidad del 97 %, valor predictivo positivo de 54 % y valor predictivo negativo de 97 % , incluyendo únicamente los gram negativos aerobios, pues de los anaerobios no se conoce ciertamente sobre la actividad biológica de esta endotoxina [Thomas, LLM., Am J Clin Pathol 1984].
Para determinar la relevancia clínica del ensayo cromogénico de LAL en la detección de sepsis por gram negativos, se recomienda que estos ensayos sean comparados con hemocultivos, aunque esta afirmación puede ser cuestionable debido a que la endotoxemia per se puede causar un cuadro clínico semejante al de la septicemia por gram negativos en ausencia de bacteremia detectable; este fenómeno se puede atribuír a generación de endotoxina por bacterias fuera de la circulación ; pero el fenómeno opuesto, bacteremia sin endotoxemia también se dá, sobre la base racional que una concentración baja de bacterias no produce un nivel de endotoxemia superior al nivel de detección del ensayo de LAL [Thomas, LLM., et al, Am J Clin Pathol 1984].
Se afirma que en pacientes en postoperatorio, con neoplasias hematológicas y neutropénicos, los hemocultivos permanecen negativos, y cuando dan resultados positivos, hay un tiempo de espera muy largo, en estos casos la detección de endotoxina provee información temprana y facilita el comienzo temprano de tratamiento, mejorando el pronóstico en este grupo de alto riesgo [Thomas, LLM., et al Clin Chim Act 1981; Cohen, J., J Infect Dis 1984]; se reportan series de pacientes quirúrgicos en las cuales hay positividad de 72 % de LAL simple con infecciones locales o sistémicas por gram negativos [Fossard, DP., et al, Brit Med J 1974].
En pacientes febriles con neoplasias hematológicas, sin infección documentada, en un 27 % se encuentran niveles de LPS altos, pero no se pudo documentar correlación entre fiebre mayor a 38 °C y concentración de endotoxina, solamente hubo fiebre en 47 % de casos con endotoxemia elevada; se desconocen los efectos que la terapia citorreductiva tenga en la sensibilidad a endotoxina en humanos para expolicar estos fenómenos [Shands, JW., et al, J Infect Dis 1989]; por otra parte, se debe tener en cuenta que la infección por gram negativos no siempre se acompaña de endotoxemia persistente y este patrón transitorio en algunas infecciones hace que el ensayo de LAL se haga repetidamente si se desean resultados confiables [Fossard, DP., et al, Brit Med J 1974].
En pacientes con bacteriuria, Jorgensen, empleando dilución de muestras ha obtenido cifras de correlación de 99 % entre el ensayo de LAL y recuentos de colonias superiores a 100.000/ml, mientras que la sensibilidad de la tinción gram fué del 75 % . La sensibilidad de LAL para bacteriuria significativa mayor a 100.000 colonias/ml fué del 86 %, con valor predictivo positivo de 94,4 % , no reportando detección con concentraciones menores a a 50.000 colonias/ml [Jorgensen, JH., et al, Am J Clin Pathol 1975]
Recursos en la web sobre lisado de amebocito de Limulus
Sadaaki Iwanaga and Shun-ichiro Kawabata: EVOLUTION AND PHYLOGENY OF DEFENSE MOLECULES ASSOCIATED WITH INNATE IMMUNITY IN HORSESHOE CRAB. Frontiers in Bioscience 3, d973-984, September 1, 1998] Hipervínculo ewn : http://www.bioscience.org/1998/v3/d/iwanaga/d973-984.htm
Recursos en la web sobre Cangrejo bayoneta (horshoe crab)
http://www.mbl.edu/marine_org/images/animals/Limulus/blood/bang.html
Writer, Internal Medicine specialist. Bogotá D.C -Colombia
Colombia
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Last edited: Nov 10, 2011 5:27 PM.
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Excelente artículo, no sabia que aun no se han hecho pruebas con anaerobios Gram negativos.
Gracias Romina, sí, hay un interesante potencial para la detección de productos bacterianos, que conjuntamente con marcadores en sangre (por ejemplo IL-6) pueden predecir mortalidad a choque séptico.